A laktóz projekt

Biotechnológiai jelentőségű fonalas gombák laktóz és D-galaktóz anyagcseréjének vizsgálata, kapcsolatuk primer és szekunder metabolitok keletkezésével
(a laktóz projekt; 2000- )

 

Előzmények:

A sajtgyártás melléktermékeként évi mintegy 1 millió tonna mennyiségben képződő laktóz (tejcukor; 1,4-0-β-D-galaktopiranozil-D-glükóz) kb. 15%-át használja fel szénforrásként a fermentációs biotechnológiai ipar olyan folyamatokban, mint a T. reesei celluláz, vagy a P. chrysogenum penicillin termelése. A laktóz tehát megújuló szénforrás, hátránya viszont, hogy a gombák lassan, egyes gazdaságilag fontos fajok (a legtöbb élesztő, Aspergillus niger) pedig egyáltalán nem tudják hasznosítani. Ennek evolúciós magyarázata lehet, hogy a laktóz a „legfiatalabb” cukor a természetben. Az Escherichia coli laktóz lebontásának szabályozása az operon-modell miatt tankönyvi ismeretnek számít, a baktériumok laktóz anyagcseréje azonban alapvetően különbözik az eukariótákétól.

A laktóz lebontás első lépése a glükózzá és galaktózzá történő hidrolízis, ami vagy az extracelluláris β-galaktozidáz vagy a laktóz permeáz és az intracelluláris β-galaktozidáz párhuzamos működésének eredményeként történik. Sejtfalhoz kötött, extracelluláris és intracelluláris β-galaktozidázokat egyaránt leírtak, sokszor egy fajon belül is. A glükóz glikolitikusan, a galaktóz pedig jellemzően a Leloir-útvonalon alakul tovább.

A Leloir-útvonal részben a lebontó anyagcsere része, melyben a D-galaktóz szén- és energiaforrásként is hasznosul, de felépítő útvonalként is működik, ilyenkor változatos funkciójú és felépítésű szénhidrátok (lipopoliszacharidok, sejtfalkomponensek, exopoli-szacharidok) szintézisében működik közre, mint a D-galaktóz építőelem szolgáltatója. Uborkában pl. a sztachióz – szacharóz átalakításnál játszik szerepet.

A Leloir útvonal első enzime az ATP-függő galaktokináz (EC 2.7.1.6), mely a D-galaktózt (kizárólag C-1 pozicióban) foszforilezi. A D-galaktóz-1-foszfátra a D-galaktóz-1-foszfát uridililtranszferáz enzim (EC 2.7.7.12) egy UDP-glükózról származó UMP-csoportot helyez, vagyis glükóz-1-foszfátot és UDP-galaktózt hoz létre. Az UDP-galaktóz szubsztrátumként szolgál az UDP-galaktóz-4-epimeráz (EC 5.1.3.2) által katalizált reakciónak, ami az UDP-glükóz regenerálását eredményezi. Az UDP-glükózra az UDP-glükóz-pirofoszforiláz enzim (EC 2.7.7.9) egy pirofoszfát csoportot rak (ezáltal elvonja az UDP-glükózt a D-galaktóz-1-foszfát uridililtranszferáz általi reverzibilis reakcióból), így glükóz-1-foszfát és UTP jön létre. Az előbbit a foszfoglükomutáz (EC 5.4.2.6) alakítja át a glikolízis közvetlen intermedierjévé, glükóz-6-foszfáttá. A Leloir-útvonal enzimei tehát a C-4 hidroxil térszerkezetét változtatják meg (epimerizáció). A laktóz anyagcsere, ezen belül a Leloir-útvonal általános vázlatát az 1. ábra szemlélteti. A Leloir-útvonal része még a D-galaktóz-mutarotáz gén illetve enzim is, mely a β-D-galaktózt alakítja át a-D-galaktózzá, még a kináz reakció előtt. Az A. niger-ből aldóz-1-epimerázként (EC 5.1.3.3) izolálták ezt az aktivitást.

1. ábra. A laktóz anyagcsere és Leloir-útvonal általános sémája
 
 
2. ábra. A D-galaktóz lebontási útvonalak vázlata.
 

Laboratóriumunk egyik fontos eredménye volt annak kísérletes bizonyítása, hogy az A. nidulans és a T. reesei a galaktokináztól függetlenül is képes a D-galaktóz hasznosítására (2. ábra). Az első, aldóz reduktáz enzimek által katalizált lépés alapján ’reduktív’-nak elkeresztelt útvonal a D-galaktóz dulcitollá (galaktitollá) történő, szigorúan NADPH-függő redukcióját, majd ennek L-szorbózzá történő, NAD+-függő, L-arabitol dehidrogenáz katalizálta dehidrogénezését foglalja magába. A glikolízisig tartó további reakciókban a fruktokináz enzim is szerepel. A két galaktóz lebontási útvonal (Leloir és reduktív) aktivitásának relatív arányát jelenleg még becsülni sem tudjuk, a fluxus-megoszlást szabályozó mechanizmusokról sem rendelkezünk ismeretekkel.

Laboratóriumi körülmények között számos szénforrás (pl. keményítő, növényi olajok, szoforóz, cellobióz, cellulóz) képes hatékonyan indukálni illetve derepresszálni a karbon katabolit represszió alá eső gének kifejeződését, de technikai és gazdasági okok miatt ezek ipari léptékben nem alkalmazhatók. Jelenleg ezért a laktóz a legfontosabb, termelői körülmények között is használható indukáló és derepresszáló szénforrás.

 

A laktóz projekt szakmailag több részre tagolódik; a részletek az alábbi linkekre kattintva ismerhetők meg.

  1. A Trichoderma reesei fonalas gomba laktóz és D-galaktóz anyagcseréje: kapcsolat a celluláz enzimek termelődésével
    Publikációs díj
  2. A Penicillium chrysogenum fonalas gomba laktóz anyagcseréje és a penicillin antibiotikum bioszintézise
  3. Az Aspergillus nidulans fonalas gomba laktóz anyagcseréjének kapcsolata a sterigmatocystin keletkezésével
  4. Az Aspergillus niger fonalas gomba D-galaktóz fenotípusának háttere, D-galaktóz hasznosításra képes mutáns előállítása

 

A laktóz projekt anyagi hátterét az alábbi pályázatok révén tudtuk biztosítani:

 

  • OTKA F031985 (Karbon katabolit represszió tanulmányozása Aspergillus nidulans-ban; 2000-2002; 3.300 eFt, témavezető: Dr. Karaffa Levente).
  • FKFP 0009/2001 (A laktóz anyagcsere vizsgálata Aspergillus nidulans-ban, különös tekintettel a karbon katabolit szabályozásra; 2001-2003; 6.000 eFt, témavezető: Dr. Karaffa Levente).
  • OTKA F042602 (Az arabinóz és a laktóz metabolizmus kölcsönhatásainak vizsgálata Aspergillus nidulans-ban; 2003-2006; 9.000 eFt, témavezető: Dr. Karaffa Levente).
  • OTKA F 031985 (A laktóz anyagcsere szabályozásának tanulmányozása Aspergillus nidulans-ban) 2001-2003 11.350 eFt, témavezető: Dr. Karaffa  Erzsébet Mónika)
  • OTKA PD 48617 (Cellulóz gének kifejeződése Trichoderma reesei-ben: a laktóz általi indukció mechanizmusa; 2004-2007; 18.302 eFt; témavezető: Dr. Fekete Erzsébet)
  • OTKA K67667 (A tejcukor lebontásának titkai, avagy miért indukálja a laktóz a Trichoderma reesei gomba celluláz génjeit?; 2007-2011; 11.000 eFt, témavezető: Dr. Karaffa Levente)
  • Osztrák Oktatási Minisztérium pályázata; GZ 45.466/1-III/B/8a/99, 1999-2001, témavezető: Prof. Christian P. Kubicek.
  • Osztrák Tudományos Kutatási Alap (FWF) pályázata (Lactose induction of cellulase gene expression in Trichoderma reesei; P16143; 2003-2005, témavezető: Prof. Christian P. Kubicek).
  • Osztrák Tudományos Kutatási Alap (FWF) pályázata (Metabolic functions of fungal L-xylulose reductases; P19421-B03, 2006-2009, témavezető: Prof. Christian P. Kubicek).
  • Osztrák-Magyar Kormányközi Együttműködési TÉT Pályázat, 1999-2000 (A-20/98).
  • Osztrák-Magyar Kormányközi Együttműködési TÉT Pályázat, 2001-2002 (A-26/2000).
  • Osztrák-Magyar Kormányközi Együttműködési TÉT Pályázat, 2004-2005 (A-5/03).
  • Osztrák-Magyar Kormányközi Együttműködési TÉT Pályázat, 2006-2007 (A-25/2005)
  • Osztrák-Magyar Kormányközi Együttműködési TÉT Pályázat, 2008-2009 (AT-18/2007).